胞外囊泡 （Extracellular Vesicles， EVs） 因其具有作為生物標(biāo)志 （biomarker） 和*工具 （therapeutic tools） 的巨大潛力而在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域日益受到關(guān)注。 然而，EVs 的異質(zhì)性 （heterogeneity） 和復(fù)雜性也為新手帶來(lái)許多挑戰(zhàn)。

為什么先看這一篇？

1. 參考 MISEV2023 指引所撰寫，提供新手清晰、實(shí)用的指引。
2. 這篇是「流程導(dǎo)航」，幫助你了解 EV 研究流程的基礎(chǔ)流程。

3. 深入技術(shù)細(xì)節(jié)及詳情，請(qǐng)見(jiàn)專文：

   ? 從探索到驗(yàn)證：為何需要“外泌體標(biāo)準(zhǔn)品”？
   ? 如何使用切向流過(guò)濾純化外泌體？

什么是胞外囊泡？ 外泌體？

胞外囊泡 （Extracellular Vesicles， EVs） 是指從細(xì)胞釋放、由脂雙層膜包裹 （delimited by a lipid bilayer） 且無(wú)自我復(fù)制能力 （replicate） 的顆粒。 在早期研究中，將 EVs 依其生物起源 （biogenesis） 和尺寸 （size） 主要分為3大類：

	外泌體 (Exosomes)	微囊泡 (Microvesicles)	凋亡小體 (Apoptotic bodies)
尺寸	40 ~ 120 nm	100 ~ 1000 nm	1000 ~ 5000 nm
生物起源	多囊體（MVB），透過(guò)內(nèi)吞途徑	細(xì)胞膜，透過(guò)向外出芽	細(xì)胞膜，細(xì)胞凋亡過(guò)程
標(biāo)志& 組成	Tetraspanin (CD9, CD63, CD81), Alix, Tsg101, flotillin-1	Selectins, Integrins	DNA, histones, cell organelles, Nuclear fractions, Annexin V.

然而，國(guó)際胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）在MISEV2018及MISEV2023建議：若無(wú)明確的生物起源證據(jù)，優(yōu)先采用作性命名，可依囊泡的物理特征、表面標(biāo)志、細(xì)胞狀況或形態(tài)進(jìn)行命名，如 sEV （小EVs）、lEV （大EVs） 及 CD63+ EV 等通用術(shù)語(yǔ)。

外泌體 （exosomes） 指源于胞內(nèi)體系統(tǒng) （endosomal system） 且經(jīng)多囊體 （MVB） 釋放的 EVs; 惟在實(shí)務(wù)上難以直接證明起源，故在缺乏證據(jù)時(shí)不建議泛用此術(shù)語(yǔ)。 其常見(jiàn)報(bào)導(dǎo)尺寸約介于 40 ~ 120 nm間，常見(jiàn)標(biāo)志為四跨膜蛋白 （tetraspanins），如 CD9、CD63、CD81 等。 外泌體可攜帶其親代細(xì)胞 （parent cell） 的核酸 （DNA、RNA）、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等分子訊息，并傳遞至受體細(xì)胞 （recipient cell） 調(diào)控其功能，影響多種生理功能及疾病進(jìn)程，具強(qiáng)大的*潛力，故成為近年研究熱點(diǎn)。

EVs 研究流程

EVs 研究涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟，包含樣品準(zhǔn)備到*后的分析和儲(chǔ)存各步驟都會(huì)影響EVs的品質(zhì)。

1. 樣品搜集及前處理 （Collection and Pre-Processing）

目的：獲取含有 EVs 的原始生物材料，并盡早移除細(xì)胞及特定污染物。

材料：EVs 可從生物源獲取，如細(xì)胞培養(yǎng)液 （cell culture-conditioned medium）、細(xì)菌 （bacteria）、血液 （blood）、尿液 （urine） 、牛奶 （milk） 等。

通用建議：
請(qǐng)報(bào)告樣品來(lái)源、數(shù)量（如體積、重量）及采集的方法及儲(chǔ)存的所有細(xì)節(jié)。
? 從原始材料中盡早移除細(xì)胞，否則細(xì)胞破損可能形成類天然 EVs 的顆粒; 細(xì)胞死亡及活化也可能會(huì)改變 EVs 的組成和功能。
? 建議在樣本儲(chǔ)存之前先完成必要的前處理，以去除可能的干擾物質(zhì)，如細(xì)胞。
? 樣品儲(chǔ)存可能對(duì) EVs 產(chǎn)生影響，請(qǐng)避免反復(fù)凍融循環(huán) （freeze‐thaw cycles）。
? 報(bào)告 EVs 分離前后的所有儲(chǔ)存條件，含防腐劑 （preservatives） 或冷凍劑 （cryoprotectants）、溫度、時(shí)間、冷凍程序、儲(chǔ)存容器、凍融循環(huán)次數(shù)和解凍方法。
* 本文僅列通用建議，針對(duì)各類樣品之個(gè)別建議，請(qǐng)查閱 MISEV2023

2. 純化與濃縮 （EV Separation and Concentration）

目的：從原始生物材料中分離 EVs、提高 EVs 濃度，同時(shí)盡可能減少非 EVs 成分 （如游離蛋白、脂蛋白、細(xì)胞碎片等） 的干擾。

純化方法：每種方法的回收率 （recovery） 及特異性 （specificity） 皆有所不同，應(yīng)依據(jù)樣品的特性選擇不同的分離 （isolation） 或富集 （enrichment）方法，如差速離心法 （dUC）、密度梯度離心法 （DG， dgUC）、 超過(guò)濾法 （UF）、粒徑篩析層析法 （SEC）、沈淀法 （ precipitation） 等。

通用建議：
依據(jù) EVs 的來(lái)源特性、研究目的以及所需的 EVs 產(chǎn)率和特異性來(lái)決定分離方法。
? 需要更高純度的 EVs 時(shí)，可考慮串聯(lián)兩種以上不同原理的純化方法
? 大體積材料來(lái)源可能需要先濃縮再分離會(huì)更有效率，如 CCM、尿液、牛奶。
? 針對(duì)市售商業(yè)套組，應(yīng)優(yōu)先選擇公開(kāi)分離原理及成分細(xì)節(jié)的套組。
? 所有 EV 分離方法皆建議提供純度與回收率佐證。
? 提供足夠的方法細(xì)節(jié)以利重現(xiàn)每個(gè)分離和濃縮步驟。
? 評(píng)估或建議新分離/濃縮方法時(shí)，請(qǐng)?jiān)诿總€(gè)步驟前/后對(duì) EVs 進(jìn)行測(cè)試，以估算其富集倍數(shù) （fold enrichment） 及產(chǎn)量 （yield）。

延伸閱讀：如何使用切向流過(guò)濾純化外泌體？

3. 定量與表征 （EV Characterization）

目的：確認(rèn)分離的顆粒是否為 EVs，可對(duì)其大小、濃度、形態(tài)和生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，是驗(yàn)證分離可靠性的關(guān)鍵步驟。

定量及表征方法：EVs 表征方法包含顆粒濃度、蛋白質(zhì)含量、脂質(zhì)含量、總 RNA 含量、EVs 形態(tài)、蛋白質(zhì)組成等。

通用建議：
? EVs 表征應(yīng)至少包含三個(gè)層面的信息：
（1） 特理與定量特性 （如顆粒濃度、粒徑分布），用以描述樣品的整體性質(zhì);
（2） EVs 標(biāo)志物 （如跨膜蛋白、GPI 錨定蛋白、胞質(zhì)或細(xì)胞膜來(lái)源蛋白），以確認(rèn)樣品為 EVs;
（3） 非 EV 共分離成份 （non-EV proteins），用以評(píng)估樣品純度并區(qū)分非 EV 來(lái)源的污染物。
? 沒(méi)有單一的測(cè)量方法能夠滿足所有表征要求，建議使用檢測(cè)極限不同的正交法 （orthogonal methods） 進(jìn)行測(cè)量。
? 報(bào)告所有分析方法的細(xì)節(jié)，包括儀器、參數(shù)和數(shù)據(jù)分析過(guò)程，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和透明度。
? 建議以生物源定義 EVs 的產(chǎn)量，如細(xì)胞的數(shù)量、生物體液體積、組織重量等。
? 應(yīng)進(jìn)行 EVs 的定量計(jì)算，如顆粒數(shù)量、蛋白質(zhì) （protein） 和/或脂質(zhì) （lipid） 含量。
? 應(yīng)對(duì) EVs 的通用成份或特定成份進(jìn)行測(cè)試，尤其有特異性要求時(shí)，如 EVs 亞型 （EV subtypes）。
? 應(yīng)根據(jù)希望達(dá)到的特異性對(duì)EV制劑進(jìn)行測(cè)試，以確定是否存在與EV亞型或EV相關(guān)的成分。
? 需確定非囊泡 （non-vesicular）、共分離 （co-isolated） 成分的存在程度。
? 使用定量指標(biāo)來(lái)表征 EVs 時(shí)，提供儀器及方法檢測(cè)極限 （LOD）。
?鼓勵(lì)使用標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照與多重檢測(cè)平臺(tái)交叉驗(yàn)證

延伸閱讀：從探索到驗(yàn)證：為何需要“外泌體標(biāo)準(zhǔn)品”？

4. 存儲(chǔ) （Storage）

目的：維持已分離 EVs 的完整性、功能和穩(wěn)定性，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。 不當(dāng)?shù)膬?chǔ)存會(huì)影響 EVs 的特性 （characteristics），包括穩(wěn)定性 （stability）、顆粒數(shù)量、聚集 （aggregation） 和功能 （function）。

通用建議：
報(bào)告 EVs 分離前后的所有儲(chǔ)存條件，含防腐劑 （preservatives） 或冷凍劑 （cryoprotectants）、溫度、時(shí)間、冷凍程序、儲(chǔ)存容器、凍融循環(huán)次數(shù)和解凍方法。
? 避免反復(fù)凍融循環(huán) （freeze-thaw cycles），建議可分裝 （aliquoting） 使用。
? 建議快速冷凍及解凍樣品，以利*限度地保留 EVs 的形態(tài)和功能。

新手地雷區(qū) 

EVs 的復(fù)雜性常常讓新手陷入一些常見(jiàn)的陷阱

• 命名混淆

  ：不加區(qū)分的使用外泌體 （exosomes） 一詞。 除能證明其生物起源，否則應(yīng)使用「胞外囊泡」（EVs） 以避免誤導(dǎo)性結(jié)論。

• 樣品污染：細(xì)胞培養(yǎng)的血清或補(bǔ)充劑常含有大量外源性 EVs 及其它因子。 進(jìn)行 EVs 相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，務(wù)必去除內(nèi)含 EVs 或直接使用無(wú)血清培養(yǎng)液，減少 EV 污染的可能性。

• 細(xì)胞干擾：搜集樣品后未能及時(shí)且徹底地移除細(xì)胞，死細(xì)胞或受損細(xì)胞則可能形成類天然 EVs 的顆粒、釋出胞內(nèi)成份、改變 EVs 組成及功能，造成結(jié)果失真。

• 分離方法選擇不當(dāng)：不同的分離方法有不同的回收率和純度及其優(yōu)缺點(diǎn)。 應(yīng)根據(jù)樣品類型、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募昂罄m(xù)應(yīng)用，選擇能夠提供足夠純度和回收率的純化方法。

• 表征不足：未充份表征或未檢測(cè)常見(jiàn)污染物 （如脂蛋白lipoprotein），不足以確認(rèn)檢測(cè)物為 EVs 或?qū)е聦?shí)驗(yàn)結(jié)論不可靠。 建議采用多種方法進(jìn)行全面的表征。

• 儲(chǔ)存不當(dāng)：反復(fù)凍融、溫度或儲(chǔ)存容器都可能導(dǎo)致 EVs 的完整性、濃度和功能受損。 務(wù)必嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存流程并詳實(shí)記錄。

參考文獻(xiàn)

• Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches
• Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines
• Biological Functions Driven by mRNAs Carried by Extracellular Vesicles in Cancer
• Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research